核果类果树病毒病检测钻研进展

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  新疆农业科学2008,45(1):52—55Xinjiang Agricultural Sciences 核果类果树病毒病检测研究进展 (石河子大学农学院园艺系,新疆石河子832003)摘要:次要概述了核果类果树常见病毒病及病毒检测方面的研究进展。动物法、电镜手艺、血清正在 病毒检测方面曾阐扬过必然的感化,但均存正在必然的错误谬误;生物学检测因其快速、活络等特点已越来越多 地使用于果树病毒的检测。针对核果类果树病毒国表里检测方面的研究进展做一综述,并提出了目前国内核 果类果树病毒研究的成长标的目的,旨正在为我国核果类果树病毒的研究供给必然的参考。 ‘环节词:核果;病毒;检测;进展 中图分类号:S一1;¥662 文献标识码:A 文章编号:1001—4330(2008)01—0052—04 Advances VirusDiseases StoneFruits DAI Yong—xin,NIU Jian—xin,YANG Xiang—kun,WANG lJn (Department Horticulture,AgriculturalCollege ShihhotzeUniversity,Shihhotze X/nj/ang 832003,China) Abstract:In paper,thecommon vires diseases viresdetection stonefruits were summaxlzed-and some perspectives were concluded,which provideflome reference stonefruits virus research.Indicator plants,electron microscope,serological methods have detection limits.Molecular biotechnologicai methods have been increasingly used virusdetection due rapidness,sensitivityetc. Key words:stone fruits;viruses;detection;advances 核果类果树品种丰硕,包罗桃(P.pers/ca)、李(P.dom/st/ca)、杏(P.armen/aca)、樱桃(P.raa//J)等 多个树种,是我国落叶果树栽培的主要品种。近年来因为病毒病的风险,严沉影响了其果实的产量和品 质,学者正努力于病毒病的研究和防治工做,正在病毒的诊断和脱除方面已取得必然的成绩。而病毒 检测是处理种苗检疫、抗病性晚期判定等根基问题的前提,也是果树无毒化栽培的根基保障。次要综述 了核果类果树病毒检测方面研究的进展。 1核果类果树次要病毒病 目前已发觉的核果类病毒病共计161种,此中樱亚属68种,桃亚属41种。李亚属32种,杏亚属20 种。桃亚属的次要侵染病毒有桃黄化病、桃痘病、桃潜现花叶病、桃褪绿叶斑病、李矮缩病等;李亚属从 要侵染病毒有李矮缩病、李痘病、李坏死环斑病、李线纹斑病等;杏亚属次要侵染病毒有坏死环斑病、苹 果褪绿叶斑病、李痘病等;樱亚属次要侵染病毒有坏死环斑病、苹果褪绿叶斑病、李矮缩病、李痘病等。 此中苹果褪绿叶斑病毒(AcLsv)、李属坏死环斑病毒(PNRSV)、李矮缩病毒(PDv)、李痘病毒(PPV)寄从 范畴广、为害严沉,国际上已将以上4种病毒做为脱毒研究的次要对象。我国判定明白的核果病毒及其 雷同病害有15种,此中桃3种、樱桃5种、李4种、杏3种…1。 2核果类果树病毒的检测手艺及其使用 2.1动物检测法 核果类果树病毒检测的根基手段是动物法。所谓动物,是指对某种或某几种病毒及雷同 病原物或株系具有反映并表示较着症状的动物,凡是有草本动物和木本动物。 收稿13期:2007—04—02 基金项目:国度天然科学基金项目(30060053、30360066);新疆出产扶植兵团科技局项目(NKB02SDXNK01SW) 做者简介:代永欣(198l一),女,人,硕士生。研究标的目的为果树生物手艺。(E—mail)daiyangxinl234@126.伽 通信做者:牛建新(1962一),男,河南人,传授,博士,博士生导师,研究标的目的为果树生物手艺,(E—mail)njxl05@163.嗍 万方数据 532.1.1草本动物法 一般采用汁液接种法,将病毒接种到草本动物上,从而研究其生物属性特征并进行品种判定。李春 3】操纵黄瓜、南瓜和斑斓猪屎豆做为草本动物,正在我国初次操纵生物学方式检测出PDV;并对PNRSV正在分歧动物上的症状表示进行了检测和研究。草本动物从侵染到发病,所需时间 短,检测过程快,但容易被虫传病毒或报酬操做所污染。 2.1.2木本动物法 目前国际上通用的尺度核果动物是GF305、Elberta、山樱桃,其对目前已知的30余种桃、38种樱 桃、14种杏、16种李的病毒均能给以。木本动物,对某种病毒有特定反映,但症状呈现需时较 长且需要良多地盘和人工,费用高贵。从田间判定到温室判定是一大前进,不只节流地盘且速度快,正在 温室内需1~4个月,正在田间最短6个月,凡是需2年摆布【4J。 2.2电镜手艺 电子显微镜的分辩率可达到0.1 nln,而病毒粒体大小正在10—100 nlTl,采用电镜可察看到有无病毒存 正在。电镜使用受几个方面:电子穿透能力低,样品必需很薄;制样需拔取病毒浓度最高的组织。由 于核果类果树病毒浓度低、分布不均衡,检测结果不是十分抱负,电镜手艺正在核果类果树病毒检测中应 用较少…1。谭海东等[5]通过病毒的提纯、电镜察看和紫外分光光度计的检测,判定出樱桃锉叶病毒 (CRLV)。 2.3血清 果树病毒血清学检测方式比以上方式精确度高、活络度高。该法目前正在我国甚至世界上仍是一种 常用的果树病毒检测方式。目前,使用最普遍的检测方式是酶联免疫吸附法(EI胳A)。并正在此根本上不 断改良,构成了很多取ELISA相关的检测方式。 2.3.1酶联免疫吸附法(ELISA) 其根基道理是因为抗体能够高度地取抗原连系,因而通过抗原一抗体的性识别反映 来进行检测。最早使用的ELISA为间接双抗体夹心法(DAS—EuSA)。Mink GI等[6]利用该手艺对李属 种子和实生苗中的PNRSV和PDV进行了检测;S Paunovic等[7]也检测到了苹果、桃、李、杏中的ACLSV。 YusufA.J等[8]8制备了PDV抗血清,并使用DAS—ELISA对PDV进行了检测。随后呈现的A卵白夹心一 ELISA法(PAS—E鹏A)和间接双抗体夹心法的精确率比DAS—ELISA高。Edwards等旧J用PAS—ELISA 和DAS—ELISA检测到18%一36%的洋李种子中带PPv;李春敏等[10]操纵PAS—ELISA检测方式,对昌 黎等地域的桃树、李树和甜樱桃树的ACLSV进行了检测。 ELISA有必然的局限:有的病毒正在某些环境下缺乏外壳卵白,而类病毒则没有外壳卵白;受病毒系 统和复合侵染的木本动物,纯化病毒和制备抗血清难于完成;寄从动物中低浓度的病毒无法检测【4J。 2.3.2单克隆抗体手艺 以单克隆抗体为根本的血清学方式是一种很是有用的病毒诊断东西,利用单克隆抗体削减了假阳 性。Hilgert等[11]用提纯的PPV—W分手物免疫小鼠后,获得了PPV的单克隆抗体。成果表白,用这些 单克隆抗体能区分PPV分歧分手物(w、A、D和M),也表白这些单克隆抗体能够用于诊断李、桃和杏中 的PIN。 以上这些判定方式正在使用中更多地受漫长的病毒纯化和浓度的。别的,抗血清之间的交叉反 应降低了病毒检测的性,障碍了近源病毒或同种病毒株系间的检测【4】。 2.3.3间接组织印迹免疫法(rIP) Knapp等[12]使用rIP正在李和苹果的长苗中检测到ACLSV、苹果茎沟病毒(ASgV)和PPV,他们认为 册能做为一种快速、精确的免疫方式用于诊断病毒,而且能确定这些病毒正在离体木本动物中的分布; 正在诊断ASGV时,P比ELISA更靠得住,由于ASGV很是局部化,并且仅局限于存正在于茎部组织中,用 ELLSA检测可能呈现假阳性。把嫁接手艺和l,IP连系起来,将为果树栽培斥地出一个普遍的尝试模式。 2.4生物学手艺 生物学检测法是通过检测病毒核酸来病毒的存正在。此方式比血清学方式的活络度要高, 能检测到pg(10.12 g)级、以至fg(10-15)级的病毒,性强,检测速度更快,操做较简洁,可用于大量样 品的检测;别的,该法顺应范畴广,其使用对象既可是DNA病毒和RNA病毒,也能够是类病毒L4J。 万方数据 ’54新疆农业科学 45卷 2.4.1核酸杂交手艺 杂交的两边利用的是探针和要检测的核酸。检测对象能够是克隆化的基因组,也能够是细胞DNA 或总RNA。所用探针必需标识表记标帜,以便示踪和检测。最后的核酸杂交试验是用放射性同位素(如妒)来标 记探针,但这对常规检测工做是晦气的,并且探针寿命短。近几年来使用非放射性探针,其更平安, 使用更少,寿命更长【4J。 目前,用来检测动物病毒的核酸杂交法中被普遍使用的方式是点杂交(DBH)。Malinowski T等[13]操纵DBH检测到桃潜现花叶类病毒(PIMvd)。正在感病果园,利用分歧长度的用放射性物质标识表记标帜的 探针检测PPV—D,最低能检测到大约5 pg的纯化病毒;正在DBH中利用放射性物质标识表记标帜的RNA探针,能 检测桃、樱桃和草本寄从中PNRSV的分歧血清型;正在检测樱桃卷叶病毒(CLRV)时,DBH顶用非放射活 性的洋地黄毒苷标识表记标帜的RNA探针检测成果和用有放射活性物质标识表记标帜的探针时一样活络【14】。M.C. Herranz.等[15]操纵“聚探针”(pob弘obe)通过点杂交对苹果花叶病毒(ApMV)、PNRSV、PDV、美国李线纹斑 病毒(APU'V)、PPV和ACLSV等六种核果病毒同时进行了检测。 2.4.2多聚酶链式反映(PCR)手艺 PCR手艺是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方式,其性强、活络度高、快速简洁而又无放 射性风险,已用于多种果树病毒的检测和诊断。 国表里均有人操纵RT—PCR手艺检测出了ACLSV[1617】、PNRSV[1819]和PDV[2021];Yun—ping动a119 等陋]对传染桃黄化卷叶(PYLR)植原体、酸樱桃绿环斑病毒(C}IGRMv)、PLMVd等病原物的木本动物进 行了PCR和RT—PCR检测。D.James等】只用一对引物通过RT—PCR对桃花叶病毒(PMV)和樱桃叶 斑驳病毒(chMLv)同时进行了检测和判定。通过RT—PCR,M.kgai等[矧正在日本初次操纵检测技 术检测到樱桃小果病毒一1(LCh一1)、LCh一2、樱桃锈斑病毒(ChNRMV)、樱桃病毒A(ChVA)、ChGRMV 等五种樱桃病毒。M.Navratil等[25]初次正在中国湖南的杏树上发觉了PPV,ELISA、RT—PCR及序列阐发 的成果都表了然PPV—D的存正在。徐文兴等[26]采用RT—PCR方式,检测到PLMVd,并确定了其全长核 苷酸序列。 正在PCR的根本上,又成长起来了很多愈加活络的检测方式。如套式PCR(嵌套PCR,Nested PCR)、免 疫捕捉PCR(IC—PCR)、复合PCR(Multiplex PCR)、原位RT—PCR(in situ RT—PCR)等。P.R.Helguer 等【27j操纵IC—RT—PCR—Nested PCR检测桃上的PNRSV时,发觉其比DAS—ELISA活络三个数量级; Antonio O.等汹J操纵及时定量RT—PCR对PPV的两个次要类型PPV—D和PPV—M进行了检测和定量 阐发。Cfistina Silva等[29J操纵原位RT—PCR检测了PDV正在杏树细胞内的分布环境。 2.4.3酶联免疫取PCR相连系的方式(PCR—ELISA) PCR—ELISA是将PCR和ELISA连系起来的一种新的检测方式,它是正在液态前提下,将曾经免疫酶 化的PCR扩减产物用酶联免疫阐发仪进行读数并阐发成果,而不需要进行电泳阐发。这种高活络的鉴 定方式曾经用正在诊断李和烟草中的PPV、ASGV等病毒,当把感病动物提取液不竭稀释时,发觉PCR— ELISA比常规的IC—PCR活络100倍[14l。A.M.Shamloul等[矧操纵Multiplex RT—PCR—ELISA对 PLMVd、啤酒花矮化类病毒(HSVd)等六品种病毒同时进行了检测。朱建裕[31】对PNRSV进行了及时荧 光RT—PCR和杂交RT—PCR—ELISA检测研究。 3核果类果树病毒的研究成长趋向 我国正在果树病毒检测方面虽然起步晚,但也取得了必然的。不外,从我国近几年果树病毒研究 ‘所取得的来看,大大都都为病毒的诊断和检测,而没有向纵深标的目的诸如病毒的分类、生物学特 ‘性、核苷酸序列阐发及株系判定等方面成长。且研究手段比力单一,大多只使用RT—PCR,而对上述更 为活络的检测手艺如Nested PCR、及时定量RT—PCR等使用研究的较少。果树病毒的检测是果树无毒 化栽培的前提和保障,因而,有需要继续研究愈加活络、愈加靠得住、愈加速速的核果类果树病毒检测方 参考文献:[1]帜,李青』李属动物脱毒手艺及病毒检测研究进展[J].林业大学学报,2001,(5):71—74. 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